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金黄色葡萄球菌多位点序列分型(MLST)
发布时间:2012年05月23日 浏览数:12776
 

【方法介绍】

     多位点序列分型(multilocus sequence typing, MLST)是基于7个相距一定距离,且基本覆盖整个染色体管家基因DNA序列为基础的分析方法。在金黄色葡萄球菌的MLST中,测定的7个管家基因分别为arc (Carbamate kinase)、aro (Shikimate dehydrogenase)、glp (Glycerol kinase)、gmk (Guanylate kinase)、pta (Phosphateacetyl transferase)、tpi (Triosephosphate isomerase)及yqi (Acetyle coenzyme Aacetyl transferase)。这7个基因既相对保守,又会发生局部点突变,具有相对变化缓慢的突变累积效应,可用于长期追踪菌株间遗传关系和宏观进化过程。

 

【标准操作流程】

1.     扩增引物

 

引物名称

靶基因

5'-3'序列

产物长度

arcC-Up

arcC

TTGATTCACCAGCGCGTATTGTC

456 bp

arcC-Dn

AGGTATCTGCTTCAATCAGCG

aroE-Up

aroE

ATCGGAAATCCTATTTCACATTC

456 bp

aroE-Dn

GGTGTTGTATTAATAACGATATC

glpF-Up

glpF

CTAGGAACTGCAATCTTAATCC

465 bp

glpF-Dn

TGGTAAAATCGCATGTCCAATTC

gmk-Up

gmk

ATCGTTTTATCGGGACCATC

429 bp

gmk-Dn

TCATTAACTACAACGTAATCGTA

pta-Up

pta

GTTAAAATCGTATTACCTGAAGG

474 bp

pta-Dn

GACCCTTTTGTTGAAAAGCTTAA

tpi-Up

tpi

TCGTTCATTCTGAACGTCGTGAA

402 bp

tpi-Dn

TTTGCACCTTCTAACAATTGTAC

yqiL-Up

yqiL

CAGCATACAGGACACCTATTGGC

516 bp

yqiL-Dn

CGTTGAGGAATCGATACTGGAAC

2.  PCR (使用25ul体系)

引物预先使用PCR水稀释至100 μM。

2×Trans Mix                12.5 μl

primer Up                    0.1 μl

primer Dn                    0.1 μl

ddH2O                        9.3 μl

DNA                            3 μl

3.  PCR程序:

94 ℃ 5 min,30 x (94 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s),72 ℃ 5 ℃ min

4.  琼脂糖凝胶电泳及测序

制备1.5%的琼脂糖凝胶,每孔点样5 μl,100 V电泳40 min,使用凝胶成像系统观察结果。观察到单一阳性条带的产物,用相应扩增引物进行双向测序。

5.   测序结果分析及MLST型别的确定

1)  观察测序结果峰图,确认序列的质量后方可进行下一步分析;

     !注意:对于MLST方法所测定的管家基因,每一个碱基的突变都是有意义的。因此若测序结果中出现了峰图杂乱或

     双峰的现象需要重新进行PCR扩增及测序,重复后没有改观则需要考虑重新进行菌株的分纯及核酸提取。

2)  将双向测序结果进行比对、拼接;

3)  登陆官方网站http://saureus.mlst.net/

4)  单击右侧“Download Alleles”,下载每一个基因的标准序列;

5)  使用多序列比对软件(如CLC Sequence Viewer中的Clastal Alignment功能;软件官方下载地址(免费):

      http://www.clcbio.com/),将待分析测序结果与相应基因的标准序列进行比对并截为标准长度(arcC、aroE,

      456 bp;glpF,465 bp;gmk,417 bp;pta,474 bp;tpi,402 bp;yqiL,516 bp;标准序列见附

      件);

6)   在http://saureus.mlst.net/页面中部“Locus Query”下拉菜单中选择Single Locus;将已经截取为标准序列长

      度的待分析序列粘贴至页面中部的文本框中,选定待分析序列的基因名称,点击Submit进行分析,网页刷新后显示

     “SEARCH RESULTS: YOUR ALLELE NUMBER IS XX”,即获取该序列的等位基因型(Allele)。

       !注意:如果序列没有截取为标准长度,或者选择了错误的基因,页面会出现以下提示(以arcC为例):“Your

       sequence is of non-standard length, standard arcc alleles are 456 bases in length, your query is

       xxx bases long…”

       !注意:如果出现了“SEARCH RESULTS :Sequence not found, closest similarity is 99% allele XX, may

       be new allele.”字样,首先需要再次确认该序列的质量。如果该序列的正反向测序结果均显示同一位点有突变,且

       峰图清晰可辨,则确认发现了新的等位基因型,可以提交至MLST官方数据库。

7)    在获得了同一菌株所有7个管家基因的等位基因型后,在页面下方左侧“Profile Query”下拉菜单中选取

       “Allelic”,页面刷新后按照提示输入各基因等位基因型,点击Query entire database进行分析。结果显示

       “Your sequence type is XX”,则该菌株的MLST分型结果为STXX。

        !注意:若7个管家基因中有任意一个为新的等位基因型,则菌株的序列型为新型,需要提交至MLST官方数据库后

        获得新的ST型别号。

        !注意:若显示“Your sequence type is not found, the closest matches are shown below…”,则需

        要重新确认每一个管家基因的等位基因型分析结果,以及输入的顺序是否有误。如果准确无误,则菌株的序列型为

        新型,需要提交至MLST官方数据库后获得新的ST型别号。

6.  MLST分型结果可以进一步使用eBURST软件进行亲缘关系分析,具体操作流程见官方网站说明。

 

【参考文献】

1.  Enright MC et al., Multilocus sequence typing for characterization of methicillin-resistant and

     methicillin-susceptible clones of Staphylococcus aureus. J Clin Microbiol. 2000 Mar;38(3):1008-15.

2.  http://saureus.mlst.net/

 

【附件】

金黄色葡萄球菌MLST分型各管家基因标准序列(Allele 1)

arcC_1

TTATTAATCCAACAAGCTAAATCGAACAGTGACACAACGCCGGCAATGCCATTGGATACTTGTGGTGCAATGTCACAGGGTATGATAGGCTATTGGTTGGAAA

CTGAAATCAATCGCATTTTAACTGAAATGAATAGTGATAGAACTGTAGGCACAATCGTTACACGTGTGGAAGTAGATAAAGATGATCCACGATTCAATAACCCA

ACCAAACCAATTGGTCCTTTTTATACGAAAGAAGAAGTTGAAGAATTACAAAAAGAACAGCCAGACTCAGTCTTTAAAGAAGATGCAGGACGTGGTTATAGAAA

AGTAGTTGCGTCACCACTACCTCAATCTATACTAGAACACCAGTTAATTCGAACTTTAGCAGACGGTAAAAATATTGTCATTGCATGCGGTGGTGGCGGTATTC

CAGTTATAAAAAAAGAAAATACCTATGAAGGTGTTGAAGCG

aroE_1

AATTTTAATTCTTTAGGATTAGATGATACTTATGAAGCTTTAAATATTCCAATTGAAGATTTTCATTTAATTAAAGAAATTATTTCGAAAAAAGAATTAGATGGCTTTA

ATATCACAATTCCTCATAAAGAACGTATCATACCGTATTTAGATCATGTTGATGAACAAGCGATTAATGCAGGTGCAGTTAACACTGTTTTGATAAAAGATGACAA

GTGGATAGGGTATAATACAGATGGTATTGGTTATGTTAAAGGATTGCACAGCGTTTATCCAGATTTAGAAAATGCATACATTTTAATTTTGGGCGCAGGTGGTGCA

AGTAAAGGTATTGCTTATGAATTAGCAAAATTTGTAAAGCCCAAATTAACTGTTGCGAATAGAACGATGGCTCGTTTTGAATCTTGGAATTTAAATATAAACCAAAT

TTCATTAGCAGATGCTGAAAAGTATTTA

glpF_1

GGTGCTGATTGGATTGTCATCACAGCTGGATGGGGATTAGCGGTTACAATGGGTGTGTTTGCTGTCGGTCAATTCTCAGGTGCACATTTAAACCCAGCGGTGTC

TTTAGCTCTTGCATTAGACGGAAGTTTTGATTGGTCATTAGTTCCTGGTTATATTGTTGCTCAAATGTTAGGTGCAATTGTCGGAGCAACAATTGTATGGTTAATGT

ACTTGCCACATTGGAAAGCGACAGAAGAAGCTGGCGCGAAATTAGGTGTTTTCTCTACAGCACCGGCTATTAAGAATTACTTTGCCAACTTTTTAAGTGAGATTA

TCGGAACAATGGCATTAACTTTAGGTATTTTATTTATCGGTGTAAACAAAATTGCCGATGGTTTAAATCCTTTAATTGTCGGAGCATTAATTGTTGCAATCGGATTAA

GTTTAGGCGGTGCTACTGGTTATGCAATCAACCCAGCACGT

gmk_1

CGAATATTTGAAGATCCAAGTACATCATATAAGTATTCTATTTCAATGACAACACGTCAAATGCGTGAAGGTGAAGTTGATGGCGTAGATTACTTTTTTAAAACTAG

GGATGCGTTTGAAGCTTTAATCAAAGATGACCAATTTATAGAATATGCTGAATATGTAGGCAACTATTATGGTACACCAGTTCAATATGTTAAAGATACAATGGACG

AAGGTCATGATGTATTTTTAGAAATTGAAGTAGAAGGTGCAAAGCAAGTTAGAAAGAAATTTCCAGATGCGCTATTTATTTTCTTAGCACCTCCAAGTTTAGAACAC

TTGAGAGAGCGATTAGTAGGTAGAGGAACAGAATCTGATGAGAAAATACAAAGTCGTATTAACGAAGCGCGTAAAGAAGTTGAAATGATGAATTTA

pta_1

GCAACACAATTACAAGCAACAGATTATGTTACACCAATCGTGTTAGGTGATGAGACTAAGGTTCAATCTTTAGCGCAAAAACTTGATCTTGATATTTCTAATATTGA

ATTAATTAATCCTGCGACAAGTGAATTGAAAGCTGAATTAGTTCAATCATTTGTTGAACGACGTAAAGGTAAAGCGACTGAAGAACAAGCACAAGAATTATTAAACA

ATGTGAACTACTTCGGTACAATGCTTGTTTATGCTGGTAAAGCAGATGGTTTAGTTAGTGGTGCAGCACATTCAACAGGAGACACTGTGCGTCCAGCTTTACAAAT

CATCAAAACGAAACCAGGTGTATCAAGAACATCAGGTATCTTCTTTATGATTAAAGGTGATGTACAATACATCTTTGGTGATTGTGCAATCAATCCAGAACTTGATT

CACAAGGACTTGCAGAAATTGCAGTAGAAAGTGCAAAATCAGCATTA

tpi_1

CACGAAACAGATGAAGAAATTAACAAAAAAGCGCACGCTATTTTCAAACATGGAATGACTCCAATTATTTGTGTTGGTGAAACAGACGAAGAGCGTGAAAGTGGTA

AAGCTAACGATGTTGTAGGTGAGCAAGTTAAGAAAGCTGTTGCAGGTTTATCTGAAGATCAACTTAAATCAGTTGTAATTGCTTATGAGCCAATCTGGGCAATCGGA

ACTGGTAAATCATCAACATCTGAAGATGCAAATGAAATGTGTGCATTTGTACGTCAAACTATTGCTGACTTATCAAGCAAAGAAGTATCAGAAGCAACTCGTATTCA

ATATGGTGGTAGTGTTAAACCTAACAACATTAAAGAATACATGGCACAAACTGATATTGATGGGGCATTAGTAGGTGGCGCA
yqiL_1

GCGTTTAAAGACGTGCCAGCCTATGATTTAGGTGCGACTTTAATAGAACATATTATTAAAGAGACGGGTTTGAATCCAAGTGAGATTGATGAAGTTATCATCGGTAAC

GTACTACAAGCAGGACAAGGACAAAATCCAGCACGAATTGCTGCTATGAAAGGTGGCTTGCCAGAAACAGTACCTGCATTTACAGTGAATAAAGTATGTGGTTCTG

GGTTAAAGTCGATTCAATTAGCATATCAATCTATTGTGACTGGTGAAAATGACATCGTGCTAGCTGGCGGTATGGAGAATATGTCTCAGTCACCAATGCTTGTCAAC

AACAGTCGCTTCGGTTTTAAAATGGGACATCAATCAATGGTTGATAGCATGGTATATGATGGTTTAACAGATGTATTTAATCAATATCATATGGGTATTACTGCTGAAA

ATTTAGTGGAGCAATATGGTATTTCAAGAGAAGAACAAGATACATTTGCTGTAAACTCACAACAAAAAGCAGTACGTGCACAGCAA

 

【文件编制】

编写:肖盟

校对:刘亚丽

 

 

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