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金黄色葡萄球菌A蛋白基因(spa)分型
发布时间:2012年05月23日 浏览数:8689
【方法介绍】

    葡萄球菌A蛋白(SPA)是金黄色葡萄球菌细胞壁的组成部分,包括Fc结合区、X域和C末端3个区域。X区基因呈现多态性,含有可变数量的24bp重复序列,重复序列两端为相对保守区域,利用这种基因的多态性建立的分型方法为spa分型。该方法分辨率高,近年来广泛用于MRSA分子进化和医院暴发流行研究。


【标准操作流程】 

1.扩增引物

spa-1113f: TAAAGACGATCCTTCGGTGAGC

spa-1514r: CAGCAGTAGTGCCGTTTGCTT

 

2.PCR(使用25ul体系)

引物预先使用PCR水稀释至100 μM

2×Trans Mix                 12.5 μl

primer Up                    0.1 μl

primer Dn                    0.1 μl

ddH2O                        9.3 μl

DNA                          3 μl

 

3.PCR程序:

94 oC 5 min30 x (94 oC 45 s60 oC 45 s72 oC 90 s)72 oC 10 min

 

4.琼脂糖凝胶电泳及测序

制备1.5%的琼脂糖凝胶,每孔点样5 μl100 V电泳40 min,使用凝胶成像系统观察结果。观察到单一阳性条带的产物,用相应扩增引物进行双向测序。

 

5. 测序结果分析及spa型别的确定

    1)观察测序结果峰图,确认序列的质量后方可进行下一步分析;

   注意:对于spa分型方法所测定的序列,每一个碱基的突变都是有意义的。因此若测序结果中出现了峰图杂乱或双峰的现象需要重新进行PCR扩增及测序,重复后没有改观则需要考虑重新进行菌株的分纯及核酸提取。

 

    2)将双向测序结果进行比对、拼接;

 

    3)序列分析:

 

    a) spa基因24bp重复序列区域的两端是相对保守的。其5’端的标志序列为RCA MCA AAA(与重复序列的5’端起始相距0bp)3’端的标志序列为TAY ATG TCG T(与重复序列的3’端末尾相距19bp18bp)。按上述规则截取spa基因重复序列区域,并按照24bp分割成不同的重复单元(repeats)

 

    b) 登陆官方网站http://www.ridom.de/spaserver/,将每个重复单元的序列粘贴到页面下方“Search for a spa-type or -repeat:”后的文本框中,点击search,即得到该重复单元的编号(例如AAAGAAGACAACAAAAAACCTGGC的编号为r02)。按5’->3’的顺序依次确定每一个重复单元的编号。

 

    c) 上述步骤完成后,将所有重复单元的编号按5’->3’的顺序依次输入文本框中,点击search,得到该菌株的spa型别。

    注意:输入时去掉每个重复单元编号前的’r’,如15-12-16-02-24-24,而非r15-r12-r16-r02-r24-r24

 

    d) 如果在搜索重复单元的编号或是spa型别时发现可能是新型,需要再次仔细的确认测序结果质量。仅当正反双向测序结果均清晰可辨时才能够初步认定为新型,可向官方网站数据库进行提交序列及峰图进行确认,若为新型别则可以获取新的型别编号。  

                                                                              编写:肖盟    校对:刘亚丽

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