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酵母样真菌菌种传代、DNA提取及菌种保存标准操作流程
发布时间:2012年05月23日 浏览数:2331
【方法介绍】

    本方法包括酵母样真菌如何复苏、传代、DNA提取和菌种保存等几个方面,可适用于常规工作及相关科学研究。该方法的建立主要基于CHIF-NET监测性研究,属于已成熟的标准化流程,具有很重要的参考价值。

 

【标准操作流程】

1.菌株复苏:(按三区划线法将留菌管内的原始菌株进行复苏)

  1) 所有菌株,显色培养基分4区,每区一株,标明菌株号、菌种名常用缩写如下:

cal: 白念珠菌 cgl:光滑念珠菌 cpa: 近平滑念珠菌 ctr: 热带念珠菌 ckr: 克柔念珠菌 cne: 新型隐球菌,其他菌种标记全名

  2) 隐球菌除传显色培养基以外,另传1/2块血平皿上述菌株统一37oC孵育48h

 

2.菌种鉴定:(48h后观察结果)

  1) 显色培养结果:

    cal:绿色 ctr:蓝色 ckr:粉色 cgl:紫色

  2) 隐球菌在血平皿上为透明白色偏小的菌落

    若不纯或出现污染,传半块显色/血平皿分纯,37oC孵育48h。显色不典型或与原始结果判读不一致的菌株,做记录并向实验负责人反应确认

 

3.分纯培养:

    挑单菌落传整块赛保罗培养基(隐球菌另传一块血平皿)1-2区之间不烧接种环,37oC孵育48h

 

4.DNA提取

   1) 需要高压物品:无菌水(400μl/菌株)200μL枪头(1/菌株)1000μL枪头(1/菌株)1.5ml EP(2/菌株);菌种保存管(2/菌株);无菌滤纸片(4-6/菌株)

   2) 准备高压过的1.5ml EP管,1/菌株

   3) 每支EP管内分装约50μl的玻璃珠,注意无菌操作

   4) 向分装好玻璃珠的EP管内加入300μl无菌水

   5) 将上述EP管对应培养基菌株号在管盖上进行编号。使用1μl一次性接种环,从三区挑取分纯的大菌落3-4个或小菌落7-8个,在EP管中充分研磨。最终浊度控制在1.0-2.0 McF之间,切勿过稀或过浓。

   6) 将盖好盖的EP管在振荡器上震荡30s(隐球菌60s)

   7) EP100oC水浴/金属浴15min,注意水浴加热时管壁/底不要触及锅壁。

   8) 将水浴后的管-80oC1-2min,待蒸汽沉降后13,200转离心5min

   9) 取新EP管编号;从离心后的EP管中小心吸取上清液200-250μl左右移入新EP管中,弃去旧管。

 

5.留取菌株

    从剩余菌苔/菌落使用无菌滤纸片刮取4-6片分装至2支菌种保存管中,菌总量约黄豆粒大小。2支菌种保存管分别装入不同盒中待存。

 

【附件】

 

菌种留取示意图


 



    

                                                                                 编写:王贺/张丽/肖盟

                                                                                 校对:刘亚丽

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